100 р бонус за первый заказ
Выберите тип работы Дипломная работа Курсовая работа Реферат Магистерская диссертация Отчёт по практике Статья Доклад Рецензия Контрольная работа Монография Решение задач Бизнес-план Ответы на вопросы Творческая работа Эссе Чертёж Сочинения Перевод Презентации Набор текста Другое Повышение уникальности текста Кандидатская диссертация Лабораторная работа Помощь on-line
Узнать цену
Стафилококкозы в стационарах 40-60%
В настоящее время род Staphylococcus уже к семейству Micrococcaceae не относится (с начала 90-х годов). Семейства Micrococcaceae не существует (т.к. генетического родства между его составляющими нет). Объединялись лишь по признаку грамположительных аэробных и факультативно-анаэробных кокков, делящихся в нескольких плоскостях.
Micrococcus - генетически родственник актиномицетов.
Staphylococcus – генетически родственник клостридий.
При исследованиях на фузобактерии, правотеллы, бактероиды (строгие анаэробы) на бескислородной среде если не применять среду с антибиотиками (аминогликозиды), то стафилококки (да и энтеробактерии) забьют всё!!!
Метод истощающего посева
Стафилококки – факультативные анаэробы. Micrococcus – строгие аэробы
Дифференциация – тест с аэробным и анаэробным расщеплением глюкозы. Все Staphylococcus глюкоза+ без газа под вазелиновым маслом. Micrococcus – нет.
Staphylococcus – более 30 видов, с подвидами – 44. Дифференцируются они по 33 тестам.
Граница галотолерантности – среда с 7,5 и более % NaCl.
Micrococcus – на 6,5% ещё растут, а выше – только Staphylococcus. (ЖСА – 10% NaCl). Некоторые виды 15% NaCl.
Молочно-солевой агар –растут микрококки, т.к. там NaCl ниже.
У буржуев – среда Чапмена - маннитолово-солевой агар (1% маннита)– 7,5% NaCl. Маннитол=маннит, как глицерол=глицерин
Целенаправленное выделение Staphylococcus (например при санитарно-бактериологических исследованиях). Зона пожелтения за счёт образования кислоты. Как его альтернатива у нас – ЖСА.
Т.е. если выделяем кокки на среда с ≥ 7,5 NaCl то они всегда глюкозо+, т.к. это Staphylococcus, а Micrococcus не растут
Морфология микрококков чуть отличается от стафилококков – и колонии и клетки крупнее , чем у стафилококков.
У каждого человека на коже 7-10 видов микрококков (а всего около 15 видов), М. luteus – преобладает - крупные желтые колонии на неингибиторных средах(старое название – воздушные сарцины, истинные сарцины в аэробных условиях не растут!!!). Равномерно красятся по Граму. В виде кучек, тетрад, пакетов. Другие – белые, бесцветные и т.п. M.livi – эмалево-белые. M.cristi - красные колонии.
Стафилококк по Граму окрашивается неравномерно (ситцевость окраски). Гроздья – чаще дает S. aureus, а так кучки, тетрады, пакеты и т.п. Стафилококки с жидкой стеды – одиночные, пары, кучки.
На средах без желтка пигмент S. aureus не образуется и колонии бывают серыми.
Каротиноиды в воде не растворяются и среда вокруг колонии никогда не окрашивается у Staphylococcus и Micrococcus.
Ангелина Гесс – в середине 19 века ввела агар в среды
Micrococcus тоже УПМФ – сепсис. In vitro чувствителен ко всему. У животных пенициллин – 5 единиц на инъекцию – на уровне изобретения пенициллина – лечит сепсис. Но in vivo лечить очень трудно. Сепсис у больных с сердечным шунтированием. Если попадают в аппарат искусственного кровообращения.
Planococcus – нас не интересуют – в морской воде и человеку не опасны
Стоматококки – 1 вид. Хорошо растут на КА (на КА вообще вырастает что угодно), но на солевых средах они не растут. Особенного клинического значения не имеют. УПМФ. Очень редко вызывают гингивиты и стоматиты (но чаще эти заболевания вызывают анаэробы и вирусы).
S. aureus subsp. aureus
S. aureus subsp. anaerobius - в аэробных условиях не растет (строгий анаэроб)
Среди стафилококков нет сапрофитов – все условно-патогенные . Более 86 нозологических форм заболеваний.
S. aureus и S.epidermidis – по 45 % всех стафилококкозов. Пищевые отравления - только S. aureus (S.epidermidis – может вызывать лишь у грудных детей). Энтеротоксины продуцируют только S. aureus.
У каждого человека 10-12 видов стафилококков живет на коже.
Передние отделы носа – главный биотоп. Там больше всего на единицу площади.
S. epidermidis также может, наряду с S. aureus вызывать вспышки ВБИ.
У новорожденных: конъюнктивиты S. epidermidis раньше в Москве в 70-х годах; госпитальные пневмонии S. epidermidis сейчас.
Плазмиды передаются со скоростью около 2 часов (2 часа стафилококк побыл на коже другого человека и получил новую плазмиду).
Носительство .
В родовспомогательных учреждениях плановое исследование на стафилококк не проводится (только при вспышках) – 345 приказ. У хирургического профиля – 720 приказ до сих пор (нигде в мире не проводится). Количество стафилококковых инфекций одинаково и у «буржуев» и у нас, независимо от санации.
По тест-системам можно дифференцировать до 12-15 видов стафилококков и несколько видов микрококков.
691 приказ – по роддомам отменен. Новый 345 приказ не имеет бактериологической части, поэтому по бактериологии все до сих пор ориентируются по 691 приказу.
Плановое обследование на носительство стафилококка отменено.
Коагулазоположительных стафилококков сейчас 5 видов.
|
коагулаза |
мальтоза |
хлопьеобразование |
Гемолиз на КА с кровью человека |
||||
|
Ч/з сутки |
Почти 100% |
||||||
|
± менее 50% |
|||||||
|
Ч/з ночь |
S. aureus не дает коагулазу очень редко – при первичных посевах от больного с массивной антибиотикотерапией. Поэтому пересеваем на косяк и потом снова ставим плазму. Если нет – это не S. aureus.
Пигмент на средах с повышенным содержанием белка и свет (ЖСА, сывороточная среда с белком)
Среди коагулазоотрицательных стафилококков некоторые тоже могут образовывать пигмент. S промагенес – на любой среде образует желтый пигмент
Ацетоин=ацетилметилкарбинол – реакция VP (Фогес-Проскауэра)
Среда Гиса с глюкозой полужидкая. При посеве с солевой среды всегда глюкозоположительны, по крайней мере, в верхней части столбика.
Окончательный отрицательный ответ по полужидкой среде Гиса с глюкозой выдаётся только на 5-е сутки.
Если газ – предполагаем, что микст или вообще не стафилококк.
Полужидкая среда с маннитом исключена в 1974 году – окончательный отрицательный ответ только на 5-е сутки. Ставится только на чашке – ответ наутро.
Плотная среда с глицерином (1%) (может заменяться любым сахаром и спиртом). Жидкие и полужидкие среды для дифференциации внутри родов Staphylococcus и Micrococcus не используются никогда. Индикатор –бромтимолсиний, рН – нейтральный; или бромкрезолкрасный, бромтимолкрасный. Сеем бляшками – до 10 культур на чашку. Радиальной полосой – до 6 культур на чашку. Вокруг стафилококка – пожелтение. Микрококки глицерин не утилизируют.
S. aurecularis на тест-системах он на 95-99% даёт аналогичность S. aureus и только по реакции плазмокоагуляции его можно отличить.
Коагулазоотрицательные стафилококки
При определённых условиях могут давать пигмент.
У стафилококков по 1-2 тестам дифференциацию до вида провести невозможно.
Растет в плазме в виде хлопьев Маннит+ всего 6-7 видов.
|
коагулаза |
Щелочная фосфатаза |
трегалоза |
||||
|
Более 20% штаммов |
||||||
|
5-10% штаммов |
||||||
|
95-100% штаммов |
||||||
|
5% штаммов |
||||||
|
S. saprophiticus |
5% штаммов |
У 100% S. aureus гемолитическая активность.
S. saprophiticus встречается очень редко. Циститы и уретриты у женщин молодого возраста – чувствителен к антибиотикам и химиопрепаратам
Коагулазонегативные не могут стать коагулазоположительными.
S. epidermidis никогда не бывает коагулазоположительным, что бы не было написано в 720 приказе
Неспоровая клетка может прожить 10-12 дней.
Щелочная фосфатаза характерна только для S. epidermidis.
Щелочная фосфатаза – паранитрофенолфосфат или фенолфталеинфосфат из тестов на ЩФ в биохимии– 50 мг на 100 мл агара до 20 штаммов на чашку.
Паранитрофенолфосфат → паранитрофенол (желтый) и окраска среды в лимонно-желтый цвет.
Фенолфталеинфосфат → фенолфталеин (бесцветный). Защелачиваем 3-10% р-ром аммиака (капаем на крышку чашки) Колонии малиновые.
Можно купить 10% р-р фенолфталеинфосфата. Хранится в холодильнике годами. 0,5 мл р-ра на 100 мл агара.
S. epidermidis природно чувствительны к новобиоцину.
Лецитовителаза (желточный фактор) – в международной классификации не используется, только у нас.
20-25% S. epidermidis лецитиназопозитивные.
На 80% S. aureus – человеческого происхождения – дают лецитовителазу. Лецитиназонегативные S. aureus – от животных.
Другие стафилококки тоже могут давать. Т. е. Если лецитовителаза+, то это на 80% S. aureus, на 20% другие стафилококки.
Чашки ЖСА на просвет – зона просветления (протеаза) – нам она не важна.
Помутнение – преобладают липазы – также не важны.
Буржуйские кровяные среды – из эритроцитов барана. Считалось, что человеческие штаммы S. aureus продуцируют только α-гемотоксин, но сейчас есть и β-гемотоксин. Это можно разобрать только на эритроцитах барана.
β-гемотоксин даёт зону неполного гемолиза через сутки, а если затем поставить до конца рабочего дня в холодильник – то зона полностью просветлеет.
S. aureus продуцирует 2 фермента
1) термолабильная ДНКаза (нуклеаза) – она есть у всех стафилококков и у большинства других микробов.
2) Термостабильная ДНКаза (нуклеаза) – есть только у S. aureus. Не разрушеется при кипячении и даже кратковременном автоклавировании.
И по нашим приказам определяется только термолабильная ДНКаза (смысла нет).
В прогретой пище (при скрытии факта ПТИ) стафилококк разрушается, а токсины остаются. По наличию термостабильной ДНКазы можно определить, был ли S. aureus.
По приказам высокополимеризированную ДНК 1-2 мг на 1 мл среды (рН=8,0). Посев на чашку бляшками (или уколом). 24 часа. Проявляем, заливая чашку 3N HCl, образуется преципитат ДНК с HCl и где ДНКаза сработала – видим зону просветления. У S. aureus радиус её 10-12 мм, у S. epidermidis её радиус 4-5 мм. Вокруг лунки с убитой культурой S. aureus – 7-8 мм.
S. epidermidis образует только термолабильную ДНКазу, S. aureus – обе ДНКазы – зона больше.
Широко распространенные стафилококковые инфекции, начавшись с заболевания верхних дыхательных путей, могут сражать весь организм. В связи с преимущественным поражением тех или иных органов материалом для исследования при стафилококковых инфекциях могут быть мокрота, гной, кровь, полоскательные носоглоточные смывы, отделяемое мочеполового тракта, пищевые продукты (преимущественно молочные и кондитерские изделия), смывы с инфицированных поверхностей, рвотные массы, эксудаты, отобранные в строгом соответствии с правилами аспектики.
При анализе материала используются микроскопический, бактериологический (выделение чистой культуры микробов и их идентификация) и биологический методы.
I. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД
Микроскопический метод имеет самостоятельное значение лишь при асептической работе с материалами, которые у здорового человека стерильны (например, кровь, спинномозговая жидкость). Обнаружение стафилококков при этом имеет самостоятельное диагностическое значение. В остальных случаях микроскопический метод применяется как предварительный, ориентировочный. При его использовании необходимо обращать внимание на количество микроорганизмов в каждом поле зрения (при стафилококковых заболеваниях патогенный возбудитель может вытеснить остальную микрофлору и обнаруживаться в мазках в громадных количествах), размеры гроздей (при высокой патогенности стафилококк усиленно делится, особи не успевают разойтись и дают большие грозди-скопления), величину отдельных особей (патогенные стафилококки в большинстве своем очень мелкие).
II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Бактериологический метод - выделение чистой культуры возбудителей и их идентификация.
Стафилококки относятся к числу весьма распространенных микроорганизмов. Они обнаруживаются и у здорового человека. Поэтому для диагностики заболевания, установления его стафилококковой природы очень важно доказать патогенность выделенных бактерий. Решение диагностической задачи при этом тесно связано с выяснением вопросов эпидемиологии, лечения и профилактики данной инфекции. На этом основании бактериологический метод складывается из нескольких этапов и направлений.
- Диагностика заболевания - выделение чистой культуры стафилококка и установление его вирулентности.
- Выявление источников инфекции и возможных путей ее распространения - фаготипирование стафилококков, выделенных из разных, но связанных между собою источников.
- Выбор наиболее эффективного способа лечения - определение чувствительности культур к антибиотикам и лечебному бактериофагу, в частности поливалентному пиофагу, моновалентному стафилофагу.
Все перечисленные этапы исследования отражены в схеме:
Выделение чистой культуры возбудителя должно осуществляется с учетом его культуральных особенностей галофильности (хорошее развитие в присутствии избыточного содержания поваренной соли при одновременном угнетении прочей микрофлоры), высокой потребности в белках и углеводах. Это достигается путем применения элективных питательных сред, выполняющих одновременно и функции дифференциально-диагностических.
СОСТАВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ СТАФИЛОКОККОВ
- 7,5% солевой МПА с pH 7,2-7,4: мясная вода - 100 мл, пептон-10 г, хлористый натрий-75 г, агар-агар - 20.0. Среда стерилизуется при +100 °C -30 минут.
- МОЛОЧНО-СОЛЕВОЙ МПА готовят из 7,5% солевого МПА, но с добавлением в расплавленную и остуженную до 45 °Cреду 10-20% стерильного снятого молока. После этого производят дробную стерилизацию 3 дня подряд по 30 минут.
- КРОВЯНОЙ МПА готовится из обычного МПА при добавлении к нему 5% дефибринированпой кроличьей или бараньей крови. Использование человеческой крови нецелесообразно.
При выполнении анализа необходимо учитывать следующие возможности отклонения от типичной характеристики стафилококков.
- Обычная грампозитивность стафилококков может теряться в процессе их изменчивости: при возникновении лекарственной устойчивости, при воздействии ультрафиолетовых лучей, лизоцима. Это надо иметь в виду при изготовлении мазков из крови, культуры с кровяного МПА.
- Пигментообразование в последние годы перестало быть устойчивым признаком стафилококков в связи с широким применением антибиотиков и их изменчивостью. Пигмент может меняться при пересевах. Золотистый пигмент не всегда совпадает с патогенностью возбудителя, а наличие белого и других пигментов не исключает участия данного стафилококка в этиологии заболевания.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ
Основными показателями вирулентности стафилококков являются гемолитическая активность, выработка фермента плазмокоагулазы и некротоксичность.
При оценке степени патогенности культур широко используются тесты Гросса, согласно которым все стафилококки можно разделить на три группы. В первую группу безусловно патогенных стафилококков включают бактерии, обладающие (резкой гемолизирующей активностью, свертывающие цитратную плазму в течение 1-2 часов и располагающие выраженными некротизирующими свойствами. Вторую группу условно-патогенных или умеренно-патогенных стафилококков составляют штампы, дающие незначительный гемолиз-на агаре с 5% кроличьей или бараньей крови, свертывающие плазму позже 6 часов, а при внутрикожном введении кролику вызывающие красноту и инфильтрат. К третьей группе непатогенных стафилококков причисляют культуры, не гемолизирующие эритроциты, не коагулирующие плазму и не обладающие некротизирующими свойствами.
Таким образом, оценка вирулентности выделенного стафилококка основана на комплексном испытании трех показателей болезнетворного действия.
Вместе с тем имеются официальные указания на то, что при выделении стафилококков из молочно-кислых продуктов, особенно длительно хранившихся в холодильнике, могут исчезать отдельные, признаки патогенности при сохранении способности к токсинообраэованию в целом. Следовательно, стафилококки, у которых выпадает один из признаков патогенности, должны считаться патогенными (Инструктивное письмо института имени Эрисмана от 1967 года).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОТОКСИНА выполняется путем прямого посева культуры на кровяной МПА, содержащий 5-10% дефибринированной кроличьей или бараньей крови. Добавление крови человека нежелательно, так как стафилококки, выделяющие альфа-гемолизин, человеческие эритроциты не разрушают и, следовательно, суждение о патогенности данного штамма, выделеннного от больного человека, окажется недостоверным.
Иногда в результате изменчивости стафилококков, а также при длительном хранении культур в неблагоприятных условиях гемолитическая активность последних ослабляется или вовсе исчезает. Для восстановления гемолизирующей способности бактерий целесообразно добавлять в среду, на которой испытывается гемотоксичность, редуцирующую смесь из расчета 0,015 г на каждые 10 мл среды. Смесь состоит из одной части Na 2 SO 3 (сульфат натрия) и двух частей Na HSO 3 (бисульфат натрия). Восстанавливающую смесь хранят в темноте и добавляют к расплавленной среде ex tempore. С целыо сохранения гемолитичности экзотоксина у стафилококковой культуры рекомендуют также к 100 мл фильтрата культуры добавлять 100 мл насыщенного раствора Na 2 S 2 0 3 (восстановитель) и 250 мл насыщенного раствора гидрохинона (стабилизатор). В. И. Иоффе предлагает для восстановления гемолитической активности добавлять на каждые 0,4 мл лишь 0,1 мл 1% раствора сульфата натрия Na 2 SO 3 .
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМОКОАГУЛАЗЫ осуществляется путем посева культуры стафилококка в узкую пробирку с 0,5 мл 5% кроличьей или человеческой цитратной плазмы. Посевы помещают в термостат на 6-10 часов с регистрацией результатов через 1, 2, 3 и 6 часов. Плазма человеческой крови дает непостоянные результаты, а донорская плазма с глюкозой и мертиолятом вообще не пригодна. В случае же невозможности замены человеческой плазмы ее используют только после 10-кратного разведения физиологическим раствором.
Наряду с классическим методом определения плазмокоагулазы применяется также реакция плазмокоагуляции на стекле или ускоренный "слид-тест". Этот методический прием основан на способности коагулазоактивных стафилококков склеиваться плазмой крови и коагулировать ее. Коагулазо-отрицательные штаммы таким свойством не обладают. Для выполнения реакции берут каплю воды, суспендируют в ней испытуемую культуру, после чего добавляют одну каплю разведенной плазмы крови кролика или человека. Через 15-60 секунд образуется плазменный сгусток. Более поздняя (позже минуты) реакция считается сомнительной, а реакция, наступившая через 3 минуты,- отрицательной.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКРОТОКСИНА производится путем внутрикожного введения кролику 0,2 мл взвеси 2 млрд, суточной агаровой культуры стафилококка в физиологическом растворе. Наблюдение за животным ведется в течение 24-48 часов. Как положительная реакция расценивается лишь инфильтрат с желтоватым центром, темным ободком и ярко-красной каймой по периферии с последующими явлениями некроза.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПАТОГЕННОСТИ СТАФИЛОКОККОВ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА ГИАЛУРОНИДАЗЫ осуществляется путем испытания культуры на субстрате, содержащем гиалуроновую кислоту. В качестве последней используются экстракт из пупочных канатиков новорожденного. Для этого пупочные канатики в количестве 3-5 штук, собранные в 0,5% раствор карболовой кислоты, тщательно отмывают от крови дистиллированной водой, очищают от сосудов, мелко нарезают и дважды пропускают через мясорубку. Затем полученный фарш взвешивают и заливают полуторным объемом дистиллированной воды, после чего в течение 30 минут оставляют при комнатной температуре, периодически встряхивая. Далее всю эту массу выливают в воронку с 2-3 слоями стерильной марли, отфильтровывают, отжимают, бросают на минуту в кипящую воду, количественно соответствующую первоначальному весу измельченных канатиков. Дают вскипеть. Жидкость быстро фильтруют через двойной слой стерильной марли в стерильные пробирки и в каждую из них для консервирован,ия субстрата добавляют несколько капель хлороформа. Затем пробирки закрывают ватной пробкой и ставит на холод для сохранения. Эстракт остается при этих условиях почти неизменным в течение нескольких месяцев.
Проба на гиалуронидазу выполняется в два этапа. Первым из них является определение рабочей дозы гиалуроновой кислоты (опыт ставят лишь 1 раз после приготовления экстракта и повторяют 1-2 раза в месяц при длительном хранении), вторым - выявление фермента гиалуронидазы.
| Схема определения рабочей дозы и титра гиалуроновой кислоты | ||||||
| Реагенты | Пробирки и их содержимое в мл | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Экстрат гиалуроновой кислоты | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 |
| Диетил. вода или физ. раствор | 0,9 | 0,8 | 0,7 | 0,6 | 0,5 | 0,4 |
| В термостат при +37 °C на 15 мин. | ||||||
| 15% раствор укс. кислоты (индикатор) | 2 к | 2 к | 2 к | 2 к | 2 к | 2 к |
| Результат (образование сгустка | - | + | + | + + | + + + | + + + + |
Пробирки помещают в термостат при 37 °C на 15 минут, после чего добавляют 2-3 капли 15% раствора уксусной кислоты, осторожно встряхивают и по образованию сгустка читают результаты. Титром гиалуроновой кислоты считается ее минимальное количество, которое при действии уксусной кислоты дает четкий сгусток. В данном примере титр гиалуронового субстрата 0,2 мл. Это же количество принимается за рабочую дозу.
Схемы определения гиалуронидазной активности культур см ниже.
Все содержимое пробирок перемешивают, ставят сначала в термостат на 15 минут, затем на холод - на 5 минут и добавляют 2-3 капли 15% уксусной кислоты. Наличие гиалуронидазы у бактерий регистрируется по отсутствию сгустка в опытной пробе. В контрольной пробирке должен проявиться хороший сгусток за счет присутствия здесь цельной гиалуроновой кислоты.
Для более точного количественного определения гиалуронидазной активности испытуемой культуры проба ставится по следующей развернутой схеме.
| Схема определения гиалуронидазной активности культур | ||
| Компоненты | Пробирки | |
| 1 | 2 | |
| (основная проба) | контроль гиалуронидазовой кислоты | |
| Экстракт гиалуроновой кислоты в рабочей дозе (в мл) | 0,2 мл | 0,2 мл |
| Фильтрат - фермент или 2 млрд. взвесь микробов в физиологическом растворе (в мл.) | 0,3 мл | - |
| Дистил. вода или физ. раствор (в мл.) | 0,2 | 0,5 мл |
| В термостат при +37 °C на 15-30 мин, затем на холод на 5 минут для прекращения действия фермента | ||
| 15% раствор уксусной кислоты | 2 капли | 2 капли |
| Схема количественного определения гиалуронидазной активности | ||||||
| Компоненты в мл | Пробирки | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| контроль гиалуроновой к-ты | ||||||
| Экстрат гиалуроновой кислоты в раб. дозе (в мл) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| Взвесь бактерий 2 млрд. (в мл) | 0,5 | 0,4 | 0,3 | 0,2 | 0,1 | - |
| Дистил. вода или физ. раствор в мл | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 |
| Выдержать в термостате, на холоде добавить индикатор 15% уксусную кислоту | ||||||
| Результат (образование сгустка) | - | - | - | + | + | + |
Титр гиалуронидазной активнсти культуры в данном примере 0,3 мл.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИБРИНОКИНАЗЫ основано на способности стафилококка лизировать фибринные сгустки свежей крови. Для испытания берут 0,5 мл бульонной суточной культуры стафилококков, вносят в 0,2 мл свежей человеческой плазмы или крови с 0,8 мл физиологического раствора. Затем осторожно перемешивают, предварительно добавив 0,5 мл 0,25% раствора хлористого калыция. Контролем в данной реакции служит пробирка со всеми теми же компонентами, но без бактерий. Пробирки помещаются в термостат при 37 °C. В течение первых 15 минут наступает свертывание. C этого момента следят за ходом растворения образовавшегося сгустка. Обычно патогенные культуры обеспечивают полный фибринолизис в течение 24 часов.
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КУЛЬТУР НА СРЕДЕ ЧЕПМЕННА. Приготовление среды: к 1 л 3,5% МПА добавляют 3,3 мл 0,1% водного растзора генцианвиолета или кристал-виолета. Готовую среду разливают в чашки. После застывания она имеет серовато-сиреневый цвет. Патогенные стафилококки дают на ней фиолетовые или оранжевые колонии, непатогенные - белые или сиреневые.
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ ПО ОТНОШЕНИЮ к манниту осуществляется на жидкой среде Гиоса, содержащей 0,5% многоатомного спирта - маннита. Патогенные стафилококки маннит разрушают через 36 часов, непатогенные значительно позже. Этот признак весьма неустойчив и самостоятельным показателем патогенности не является.
УСКОРЕННЫЙ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ
И ИНДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ ПО ПЕТРУ ДАНИЛА
Метод основан на комплексном использовании обычного кровяного МПА с бараньими эритроцитами и среды с маннитом, хлористым натрием и теллуритом калия, рецепт которой разработан Петру Данила.
СРЕДА ПЕТРУ ДАНИЛА ИМЕЕТ СЛЕДУЮЩИЙ СОСТАВ: дистиллированная вода-100 мл; пептон - 0,5 г; хлористый натрий -10 г; маннит или лактоза-0,5 г; теллурит калия-0,5 г; бромтимоблау - 0,004 г.
Приготовление среды: в теплой воде растворяют пептон, соль, добавляют 2 мл раствора бромтимолбау (0,1 г на 3,2 мл N/20 раствора едкого натрия и 50 мл дистиллированной воды), стерилизуют при +120 °C в течение 15 минут. После охлаждения добавляют 5 мл 10% водного раствора маннита или лактозы, простерилизованного кипячением и 5 мл 1 % водного раствора теллурита натрия, простерилизованнаго в автоклаве. Среда темно-зеленая, pH -7,6. При синем цвете в нее добавляется несколько капель 10% соляной кислоты. Среду разливают по 1-2 мл в пробирки.
Пожелтение среды Петру Данила через 24 часа после посева культуры и гемолиз вокруг колоний стафилококка свидетельствуют о выделении патогенных бактерий.
УСКОРЕННАЯ КОМПЛЕКСНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПАТОГЕННОГО СТАФИЛОКОККА ПО ПЕТРУ ДАНИЛА
Дифференциация патогенных стафилококков производится в одной пробирке. Метод основан на способности патогенных стафилококков агглютинироваться в присутствии человеческой плазмы, коагулировать ее, а также вызывать при этом агглютинацию гомологичных эритроцитов. Для выполнения пробы к 1 мл нитратной человеческой плазмы добавляют 10 мл физиологического раствора и 0,05 мл осевшей под плазмой эритроцитарной массы. Пробирку встряхивают и 0,5 мл смеси переливают в другую пробирку. Сюда же вносят как можно больше культуры стафилококка, которую осторожно растирают на стенке пробирки близко от жидкого субстрата, слегка прикасаясь к его поверхности. Растирание продолжают до получения гомогенной взвеси. Патогенный стафилококк агглютинируется плазмой, и гомогенизации не происходит, непатогенный - образует равномерную гомогенную массу.
Патогенные стафилококки при растирании культуры в плазменном субстрате образуют зернистую негомогенную взвесь, а после инкубирования в термостате вызывают гемагглютинацию эритроцитов и плазмокоагуляцию. Непатогенные штампы образуют при этом равномерную мутную взвесь, а коагуляции плазмы и склеивания эритроцитов не наступает.
| Таб. 1. Типы фагов | |
| Группа | Бактериофаги |
| I | 29, 52, 52А, 79, 80 |
| II | 3А, 3В, 36, 55, 71 |
| III | 6, 7, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А |
| IV | 42Д |
| V | 81 и 187 |
ФАГОТИПИРОВАНИЕ СТАФИЛОКОККОВ
В различных местностях циркулируют разные фаготипы стафилококков. Поэтому определение их у стафилококковых культур имеет большое значение для выяснения возможного источника инфекции и путей ее распространения.
Среди плазмокоагулирующих стафилококков по номенклатуре Международного Комитета по фаготипированию различают 22 типа фагов (таб.1):
Определение лизируемости стафилококков названными бактериофагами выполняется следующим образом.
ПОДГОТОВКА КУЛЬТУР К ФАГОТИПИРОВАНИЮ
- Определение плазмокоагулирующей способности культур (бактериофагами цитируется только коагулазоположительные штаммы).
- Подготовка культуры: носер в МПБ с pH -7, 2-7, 4, выращивание при +37 °C 18-24 часа.
- На следующий день - пересев в свежий МПБ с тем же pH, подращивание культуры в термостате в течение 3 часов.
ФАГОТИПИРОВАНИЕ
- Чашки со свежеприготовленным 1,25% МПА подсушить в термостате в течение 1-1,5 часов.
- Разделить дно чашки карандашом по стеклу на 23-24 квадрата, в каждом из которых подписать типы испытуемых бактериофагов.
- Засеять чашку 0,2 мл 3-4 часовой культуры выделенного стафилококка и равномерно распределить шпателем по поверхности среды.
- Подсушить посев в термостате при +37 °C в течение 30-45 минут.
- В каждый квадрат петлей нанести каплю соответствующего бактериофага в десятикратном разведении (1:10), произведенном в бульоне Хоттингерa.
- Каплю фага подсушить, чашки поставить в термостат на 18-20 часов в перевернутом виде.
- Учет результатов и определение фаготипа стафилококка производится по наличию стерильного пятна на месте лизиса культуры.
Положительным считается результат, степень лизиса при котором определяют не менее как на 2 плюса. В этом случае зона лизиса составляет около 50% площади в месте нанесения бактериофага.
Во многих случаях культуры стафилококков лизируются не одним, а несколькими фагами, образуя своеобразую фагомозаику из стерильных пятен. Стафилококки, обнаруживающие одну и ту же мозаику или отличающиеся на 1 фаг, считаются идентичными.
БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Биологический метод диагностики применяется только при подозрении на пищевую интоксикацию, вызванную энтеротропными стафилококками, выделяющими энтеротоксин. Принцип его сводится к скармливанию остатков пищи, подозрительной на инфицированность стафилококком, выделенной культуры, промывных вод. Лучшей биологической моделью при этом являются 1,5-2-месячные котята (для исследования культуры) и взрослые кошки (при выявлении энтеротоксина). При капельных стафилококковых инфекциих этот метод не применяется.
- Руководство по диагностике инфекционных заболеваний под ред. проф. К. И. Матвеева и М. И. Соколова. 1964, стр. 549-553, 489-492.
- Предтеченский Б. Е. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям, стр. 719-774, 776-786, 890- 896.
- Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеванияй, стр. 307-313.
- Руководство но микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных заболеваний, т. VI, разд. VI, стр. 475- 487.
- Сборник схем бактериологического исследования при некоторых инфекционных заболеваниях. Методическое пособие для врачей-курсантов заочников, под ред. проф. П. Н. Кашкина, 1965, стр. 4
- Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргер, 1967, стр. 7-16, 250-254.
- Выгодчиков Г. В. Стафилококковые инфекции. Медгиз. 1963.
Источник : Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973
Стафилококк был обнаружен в 1878 г. Р. Кохом и в 1880 г. Л. Пастером в гнойном материале. Л. Пастер, заразив кролика, окончательно доказал роль стафилококка как возбудителя гнойного воспаления. Название «стафилококк» дал в 1881 г. А. Огстон (из-за характерного расположения клеток), а подробно описал его свойства в 1884 г. Ф. Розенбах. Стафилококки – грамположительные, правильной геометрической формы шаровидные клетки диаметром 0,5 – 1,5 мкм, располагающиеся обычно в виде гроздьев (см. цв. вкл., рис. 92), каталазопозитивны, восстанавливают нитраты в нитриты, активно гидролизуют белки и жиры, сбраживают в анаэробных условиях глюкозу с образованием кислоты без газа. Обычно могут расти в присутствии 15 %-ного NaCl и при температуре 45 °C. Содержание Г + Ц в ДНК – 30 – 39 мол %. Стафилококки не имеют жгутиков, не образуют спор. Они широко распространены в природе. Их главным резервуаром являются кожные покровы человека и животных и их слизистые оболочки, сообщающиеся с внешней средой. Стафилококки – факультативные анаэробы, лишь один вид (Staphylococcus saccharolyticus ) – строгий анаэроб. Стафилококки не требовательны к питательным средам, хорошо растут на обычных средах, температурный оптимум для роста 35 – 37 °C, рН 6,2 – 8,4. Колонии круглые, 2 – 4 мм в диаметре, с ровными краями, выпуклые, непрозрачные, окрашены в цвет образуемого пигмента. Рост в жидкой культуре сопровождается равномерным помутнением, со временем выпадает рыхлый осадок. При росте на обычных средах стафилококки не образуют капсулы, однако при посеве уколом в полужидкий агар с плазмой или сывороткой большинство штаммов S. aureus образует капсулу. Бескапсульные штаммы в полужидком агаре растут в виде компактных колоний, капсульные – образуют диффузные колонии.
Стафилококки обладают высокой биохимической активностью: ферментируют с выделением кислоты (без газа) глицерин, глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, маннит; образуют различные ферменты (плазмокоагулазу, фибринолизин, лецитиназу, лизоцим, щелочную фосфатазу, ДНКазу, гиалуронидазу, теллуритредуктазу, протеиназу, желатиназу и др.). Указанные ферменты играют важную роль в метаболизме стафилококков и во многом определяют их патогенность. Такие ферменты, как фибринолизин и гиалуронидаза, обусловливают высокую инвазивность стафилококков. Плазмокоагулаза является главным фактором их патогенности: она защищает от фагоцитоза и переводит протромбин в тромбин, который вызывает свертывание фибриногена, в результате чего каждая клетка покрывается белковой пленкой, защищающей от фагоцитов.
Классификация. Род Staphylococcus включает в себя более 20 видов, которые подразделяются на две группы – коагулазоположительные и коагулазоотрицательные стафилококки. Для дифференциации видов используют различные признаки (табл. 22).
Таблица 22
Дифференциальные признаки основных видов стафилококков
Примечание. (+) – признак положительный; (–) – признак отрицательный; + (–) – признак непостоянный;? – неизвестно.
I. Коагулазоположительные стафилококки:
1. S. aureus ***.
2. S. intermedius **.
3. S. hyicus a .
II. Коагулазоотрицательные стафилококки:
* Патогенные только для человека.
** Патогенные только для животных.
*** Патогенные для человека и животных.
a Не все штаммы S. hyicus имеют коагулазу.
Патогенными для человека являются, главным образом, коагулазоположительные стафилококки, но многие коагулазоотрицательные также способны вызывать заболевания, особенно у новорожденных детей (конъюнктивит новорожденных, эндокардит, сепсис, заболевания мочевыводящих путей, острый гастроэнтерит и др.). S. aureus в зависимости от того, кто является его основным носителем, разделяется на 10 эковаров (hominis, bovis, ovis и др.).
У стафилококков обнаружено более 50 типов антигенов, к каждому из них в организме образуются антитела, многие из антигенов обладают аллергенными свойствами. По специфичности антигены подразделяют на родовые (общие для всего рода Staphylococcus ); перекрестно реагирующие – антигены, общие с изоантигенами эритроцитов, кожи и почек человека (с ними связаны аутоиммунные заболевания); видовые и типоспецифические антигены. По типоспецифическим антигенам, выявляемым в реакции агглютинации, стафилококки разделяют более чем на 30 серовариантов. Однако серологический метод типирования стафилококков не получил еще широкого применения. К числу видоспецифических относят белок А, который образует S. aureus . Этот белок располагается поверхностно, он ковалентно связан с пептидогликаном, его м. м. составляет около 42 кД. Белок А особенно активно синтезируется в логарифмической фазе роста при температуре 41 °C, термолабилен, не разрушается трипсином; уникальным его свойством является способность связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов IgG (IgG 1 , IgG 2 , IgG 4), в меньшей степени с IgM и IgA. На поверхности белка А выявлено несколько участков, способных соединяться с участком полипептидной цепи иммуноглобулина, расположенным на границе доменов СН 2 и СН 3 . Это свойство нашло широкое применение в реакции коагглютинации: стафилококки, нагруженные специфическими антителами, у которых остаются свободными активные центры, при взаимодействии с антигеном дают быструю реакцию агглютинации.
Взаимодействие белка А с иммуноглобулинами приводит к нарушениям функций систем комплемента и фагоцитов в организме больного. Он обладает антигенными свойствами, является сильным аллергеном и индуцирует размножение Т– и В-лимфоцитов. Его роль в патогенезе стафилококковых заболеваний выяснена еще не полностью.
Штаммы S. aureus различаются по чувствительности к стафилококковым фагам. Для типирования S. aureus используют международный набор из 23 умеренных фагов, которые разделены на четыре группы:
1-я группа – фаги 29, 52, 52А, 79, 80;
2-я группа – фаги 3А, 3С, 55, 71;
3-я группа – фаги 6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А, 84, 85;
4-я группа – фаги 94, 95, 96;
вне групп – фаг 81.
Отношение стафилококков к фагам своеобразное: один и тот же штамм может лизироваться либо одним фагом, либо одновременно несколькими. Но поскольку чувствительность их к фагам является признаком относительно стабильным, фаготипирование стафилококков имеет важное эпидемиологическое значение. Недостаток этого метода состоит в том, что типированию поддается не более 65 – 70 % S. aureus . В последние годы получены наборы специфических фагов и для типирования S. epidermidis .
Факторы патогенности стафилококков. Стафилококк – уникальный микроорганизм. Он может вызывать более 100 различных заболеваний, относящихся к одиннадцати классам по Международной классификации 1968 г. Стафилококки могут поражать любую ткань, любой орган. Это свойство стафилококков обусловлено наличием у них большого комплекса факторов патогенности.
1. Факторы адгезии – прикрепление стафилококков к клеткам тканей обусловлено их гидрофобностью (чем она выше, тем сильнее проявляются адгезивные свойства), а также адгезивными свойствами полисахаридов, возможно также белка А, и способностью связывать фибронектин (рецептор некоторых клеток).
2. Разнообразные ферменты, играющие роль факторов «агрессии и защиты»: плазмокоагулаза (главный фактор патогенности), гиалуронидаза, фибринолизин, ДНКаза, лизоцимоподобный фермент, лецитиназа, фосфатаза, протеиназа и т. д.
3. Комплекс секретируемых экзотоксинов:
эритроцитов, некроз при внутрикожном введении кролику, разрушение лейкоцитов, смерть кролика при внутривенном введении. Однако оказалось, что такой эффект вызывает один и тот же фактор – мембраноповреждающий токсин. Он обладает цитолитическим действием в отношении различных типов клеток, которое проявляется следующим образом. Молекулы этого токсина сначала связываются с неизвестными пока рецепторами мембраны клетки-мишени или неспецифически абсорбируются липидами, содержащимися в мембране, а затем формируют из 7 молекул грибовидный гептамер, состоящий из 3 доменов. Домены, формирующие «шляпку» и «край», расположены на внешней поверхности мембран, а домен «ножки» служит трансмембранным каналом-порой. Через нее и происходит вход и выход небольших молекул и ионов, что ведет к набуханию и гибели клеток, имеющих ядро, и осмотическому лизису эритроцитов. Обнаружено несколько типов мембраноповреждделенных от человека, он лизирует эритроциты человека, кроликов и баранов. Летальный эффект у кроликов вызывает при внутривенном введении через 3 – 5 мин. Гемолизинует эритроциты человека и многих видов животных. Летальное действие на кролика при внутривенном введении вызывает через 16 – 24 – 48 ч. Очень часто у стафилококков об
б) эксфолиативные токсины А и В различают по антигенным свойствам, отношению к температуре (А – термостабилен, В – термолабилен), локализации генов, контролирующих их синтез (А контролируется хромосомным геном, В – плазмидным). Нередко у одного и того же штамма S. aureus синтезируются оба эксфолиатина. С этими токсинами связана способность стафилококков вызывать пузырчатку у новорожденных, буллезное импетиго, скарлатиноподобную сыпь;
в) истинный лейкоцидин – токсин, отличающийся от гемолизинов по антигенным свойствам, избирательно действует на лейкоциты, разрушая их;
г) экзотоксин, вызывающий синдром токсического шока (СТШ). Он обладает свойствами суперантигена. Для СТШ характерны повышение температуры, снижение артериального давления, кожные высыпания с последующим шелушением на кистях и стопах, лимфоцитопения, иногда диарея, поражение почек и др. К продукции и секреции этого токсина способны более 50 % штаммов S. aureus .
4. Сильные аллергизирующие свойства, которыми обладают как компоненты структуры клеток, так и экзотоксины и другие секретируемые бактериями продукты жизнедеятельности. Стафилококковые аллергены способны вызывать реакции гиперчувствительности как замедленного типа (ГЧЗ), так и немедленного типа (ГЧН). Стафилококки являются главными виновниками кожных и респираторных аллергий (дерматиты, бронхиальная астма и т. п.). Особенность патогенеза стафилококковой инфекции и ее тенденция к переходу в хроническую форму коренятся в эффекте ГЧЗ.
5. Перекрестно реагирующие антигены (с изоантигенами эритроцитов А и В, почек и кожи – индукция аутоантител, развитие аутоиммунных заболеваний).
6. Факторы, угнетающие фагоцитоз. Наличие их может проявляться в угнетении хемотаксиса, защите клеток от поглощения фагоцитами, в обеспечении стафилококкам возможности размножаться в фагоцитах и блокировке «окислительного взрыва». Фагоцитоз угнетают капсула, белок А, пептидогликан, тейхоевые кислоты, токсины. Кроме того, стафилококки индуцируют синтез некоторыми клетками организма (например, спленоцитами) супрессоров фагоцитарной активности. Угнетение фагоцитоза не только препятствует очищению организма от стафилококков, но и нарушает функцию процессинга и представления антигенов Т– и В-лимфоцитам, что ведет к снижению силы иммунного ответа.
Наличие капсулы у стафилококков повышает их вирулентность для белых мышей, делает устойчивыми к действию фагов, не позволяет типировать агглютинирующими сыворотками и маскирует белок А.
Тейхоевые кислоты не только защищают стафилококки от фагоцитоза, но, очевидно, играют существенную роль в патогенезе стафилококковых инфекций. Установлено, что у детей, страдающих эндокардитом, в 100 % случаев обнаруживаются антитела к тейхоевым кислотам.
7. Митогенное действие стафилококков в отношении лимфоцитов (этим действием обладают белок А, энтеротоксины и другие продукты, секретируемые стафилококками).
8. Энтеротоксины A, B, C1, C2, C3, D, E. Они характеризуются антигенной специфичностью, термостабильностью, устойчивостью к действию формалина (не превращаются в анатоксины) и пищеварительных ферментов (трипсина и пепсина), устойчивы в диапазоне рН от 4,5 до 10,0. Энтеротоксины являются низкомолекулярными белками с м. м. от 26 до 34 кД со свойствами суперантигенов.
Установлено также, что существуют генетически обусловленные различия в чувствительности к стафилококковой инфекции и характеру ее течения у людей. В частности, тяжелые стафилококковые гнойно-септические заболевания чаще обнаруживаются у людей с группами крови А и АВ, реже – у лиц 0 и В групп.
С синтезом энтеротоксинов связана способность стафилококков вызывать пищевые отравления типа интоксикации. Чаще всего они вызываются энтеротоксинами A и D. Механизм действия этих энтеротоксинов мало изучен, но он отличается от действия других бактериальных энтеротоксинов, которые нарушают функцию аденилатциклазной системы. Все типы стафилококковых энтеротоксинов вызывают сходную картину отравления: тошнота, рвота, боли в поджелудочной области, диарея, иногда головная боль, повышение температуры, мышечный спазм. Эти особенности стафилококковых энтеротоксинов обусловлены их суперантигенными свойствами: они индуцируют избыточный синтез интерлейкина-2, который и вызывает интоксикацию. Энтеротоксины возбуждают гладкую мускулатуру кишечника и повышают моторику желудочно-кишечного тракта. Отравление чаще всего связано с употреблением инфицированных стафилококком молочных продуктов (мороженого, пирожных, тортов, сыра, творога и т. п.) и консервов с маслом. Инфицирование молочных продуктов может быть связано с маститами у коров или с гнойно-воспалительными заболеваниями людей, имеющих отношение к производству продуктов.
Таким образом, обилие различных факторов патогенности у стафилококков и их высокие аллергизующие свойства обусловливают особенности патогенеза стафилококковых заболеваний, их характер, локализацию, тяжесть течения и клинические проявления. Авитаминоз, диабет, снижение иммунитета способствуют развитию стафилококковых заболеваний.
Резистентность стафилококков. Среди не образующих спор бактерий стафилококки, как и микобактерии, обладают наибольшей устойчивостью к внешним факторам. Они хорошо переносят высыхание и остаются жизнеспособными и вирулентными неделями и месяцами в сухой мельчайшей пыли, являясь источником пылевой инфекции. Прямой солнечный свет убивает их лишь в течение многих часов, а рассеянный действует очень слабо. Они устойчивы и к высокой температуре: нагревание до 80 °C выдерживают около 30 мин, сухой жар (110 °C) убивает их в течение 2 ч; низкие температуры переносят хорошо. Чувствительность к химическим дезинфектантам сильно варьирует, например, 3 %-ный раствор фенола убивает их в течение 15 – 30 мин, а 1 %-ный водный раствор хлорамина – за 2 – 5 мин.
Особенности эпидемиологии. Поскольку стафилококки являются постоянными обитателями кожи и слизистых оболочек, заболевания, вызываемые ими, могут иметь характер либо аутоинфекции (при различных повреждениях кожи и слизистых оболочек, в том числе и при микротравмах), либо экзогенной инфекции, обусловленной контактно-бытовым, воздушно-капельным, воздушно-пылевым или алиментарным (при пищевых отравлениях) способами заражения.
Особое значение имеет носительство патогенных стафилококков, так как носители, особенно в медицинских учреждениях (различные хирургические клиники, родильные дома и т. п.) и в закрытых коллективах, могут стать причиной стафилококковых инфекций. Носительство патогенных стафилококков может иметь временный или перемежающийся характер, но особую опасность для окружающих представляют лица, у которых оно является постоянным (резидентные носители). У таких людей стафилококки длительное время и в большом количестве персистируют на слизистых оболочках носа и зева. Причина длительного носительства не совсем ясна. Оно может быть следствием ослабления местного иммунитета (недостаток секреторных IgA), нарушения функций слизистой оболочки, повышения адгезивных свойств стафилококка или обусловлено какими-либо другими его свойствами.
Особенности патогенеза и клиники. Стафилококки легко проникают в организм через мельчайшие повреждения кожи и слизистых оболочек и могут вызвать самые различные заболевания – от юношеских угрей (acne) до тяжелейшего перитонита, эндокардита, сепсиса или септикопиемии, при которых летальность достигает 80 %. Стафилококки вызывают фурункулы, гидрадениты, абсцессы, флегмоны, остеомиелиты; в военное время – частые виновники гнойных осложнений ран; стафилококки играют ведущую роль в гнойной хирургии. Обладая аллергенными свойствами, они могут стать причиной псориаза, геморрагического васкулита, рожистого воспаления, неспецифического полиартрита. Инфицирование стафилококками пищевых продуктов – частая причина пищевых отравлений. Стафилококки – главные виновники сепсиса, в том числе у новорожденных. В отличие от бактериемии (бактерии в крови), которая является симптомом болезни и наблюдается при многих бактериальных инфекциях, сепсис (септицемия – гнилокровие) представляет собой самостоятельную болезнь с определенной клинической картиной, в основе которой лежит поражение органов ретикулоэндотелиальной системы (системы мононуклеарных фагоцитов – СМФ). При сепсисе имеется гнойный очаг, из которого в кровь периодически поступает возбудитель, разносится по организму и поражает ретикулоэндотелиальную систему (СМФ), в клетках которой он размножается, выделяя токсины и аллергены. При этом клиническая картина сепсиса слабо зависит от вида возбудителя, а определяется поражением тех или иных органов.
Септикопиемия – форма сепсиса, при котором возбудитель вызывает гнойные очаги в различных органах и тканях, т. е. это сепсис, осложненный гнойными метастазами.
Бактериемия при сепсисе и септикопиемии может быть кратковременной и длительной.
Постинфекционный иммунитет существует, он обусловлен как гуморальными, так и клеточными факторами. Важную роль в нем играют антитоксины, антимикробные антитела, антитела против ферментов, а также Т-лимфоциты и фагоциты. Напряженность и длительность иммунитета против стафилококков изучены недостаточно, так как у них слишком разнообразна антигенная структура, а перекрестного иммунитета нет.
Лабораторная диагностика. Основной метод – бактериологический; разработаны и внедрены серологические реакции. В случае необходимости (при интоксикациях) прибегают к биологической пробе. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, гной, слизь из зева, носа, отделяемое ран, мокрота (при стафилококковой пневмонии), испражнения (при стафилококковом колите), в случае пищевых интоксикаций – рвотные массы, испражнения, промывные воды желудка, подозрительные продукты. Материал засевают на кровяной агар (гемолиз), на молочно-солевой (молочно-желточно-солевой) агар (угнетается рост посторонних бактерий за счет NaCl, лучше выявляются пигмент и лецитиназа). Выделенную культуру идентифицируют по видовым признакам, определяют у нее наличие основных признаков и факторов патогенности (золотистый пигмент, сбраживание маннита, гемолиз, плазмокоагулаза), обязательно проверяют чувствительность к антибиотикам, в случае необходимости проводят фаготипирование. Из числа серологических реакций для диагностики гнойно-септических заболеваний применяют РПГА и ИФМ, в частности для определения антител к тейхоевой кислоте или к видоспецифическим антигенам.
Для определения энтеротоксигенности стафилококков используют три метода:
1) серологический – с помощью специфических антитоксических сывороток в реакции преципитации в геле обнаруживают энтеротоксин и устанавливают его тип;
2) биологический – внутривенное введение фильтрата бульонной культуры стафилококка кошкам в дозе 2 – 3 мл на 1 кг веса. Токсины вызывают у кошек рвоту и понос;
3) непрямой бактериологический метод – выделение из подозрительного продукта чистой культуры стафилококка и определение у него факторов патогенности (образование энтеротоксина коррелирует с наличием других факторов патогенности, в частности РНК-азы).
Наиболее простым и чувствительным является серологический метод обнаружения энтеротоксина.
Лечение. Для лечения стафилококковых заболеваний используют главным образом бета-лактамные антибиотики, к которым прежде всего следует определять чувствительность. При тяжелых и хронических стафилококковых инфекциях положительный эффект дает специфическая терапия – применение аутовакцины, анатоксина, противостафилококкового иммуноглобулина (человеческого), антистафилококковой плазмы.
Специфическая профилактика. Для создания искусственного иммунитета против стафилококковой инфекции применяют стафилококковый анатоксин (жидкий и таблетированный), но он создает антитоксический иммунитет только против стафилококков, лизируемых главным образом фагами I группы. Применение вакцин из убитых стафилококков или их антигенов хотя и приводит к появлению антимикробных антител, но только против тех серовариантов, из которых изготовлена вакцина. Проблема изыскания высокоиммуногенной вакцины, эффективной против многих видов патогенных стафилококков, – одна из важнейших проблем современной микробиологии.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus - факультативно анаэробные грамположительные кокки, неподвижные, каталазо- и коагулазоположительные. Некоторые штаммы S. aureus продуцируют стафилококковые энтеротоксины (SEs), вызывающие пищевые отравления. Стафилококки присутствуют в воздухе, пыли, сточных водах, воде, молоке, продуктах питания, а также на оборудовании пищевых производств, на различных поверхностях в окружающей среде, на кожных покровах людей и животных. Именно люди и животные являются основным резервуаром инфекции. Стафилококки присутствуют в полостях носа, и горле, а также на волосах и кожном покрове по крайней мере у 50% здоровых людей. Staphylococcus aureus способен расти в широком диапазоне температур от 7 до 48,5°С (оптимум 30 - 37°С); рН 4,2 - 9,3 (оптимум рН 7,0-7,5) и при высокой концентрации хлорида натрия (до 15% NaCl). Такие свойства позволяют бактериям заселять самые разнообразные продукты. Продукты, наиболее часто являющиеся причиной стафилококковых пищевых отравлений - это мясо и мясопродукты, мясо птицы, яйца, салаты (содержащие яйцо, тунец, курицу, картофель, макароны), кондитерские изделия (например, пирожки с кремом, шоколадные эклеры), начинка сэндвичей, молоко и молочные продукты. Таким образом, продукты, которые в процессе приготовления значительное время обрабатыватся вручную и впоследствии хранятся в тепле, могут быть реальным источником стафилококковых пищевых отравлений.
Интоксикация при стафилококковой инфекции
Причиной болезни являются продуцируемые Staphylococcus aureus токсины, поэтому заболевание характеризуется очень коротким инкубационным периодом - обычно от 0,5 до 6 часов. Восприимчивость больного к токсинам определяется состоянием больного, концентрацией токсина и количеством съеденного зараженного продукта. Инфекционная доза может быть менее 1,0 мкг, что соответствует примерно 100.000 КОЕ/г продукта. Наиболее распространенными симптомами заболевания являются тошнота, рвота, отвращение к пищи, спазмы в животе и диарея. Период реабилитации занимает, как правило, 1-3 дня, но в тяжелых случаях полное восстановление может занять больше времени. Болезнь не передается окружающим, больным необходимо принимать большое количества жидкости.
Патогенность, масштабы заболевания
Коагулозоположитепльные стафилококки - это грамположительные каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу (S. аureus; S. aureus spp. anaerobius) или специфическую для кроличьей плазмы реакцию на агаре с кроличьей плазмой и фибриногеном при определении стандартным методом. Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк) - это коагулозоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях в процессе определения этих биохимических тестов стандартным методом.
Согласно недавним исследованиям в развитых странах из всех известных инфекций чаще всего к смерти приводит одна из самых известных, «обыкновенных» бактерий - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк; все штаммы стафилококков, продуцирующие коагулазу, называют золотистыми ). Этот условно-патогенный микроорганизм выделяют у 15-30% здоровых людей, причем носительство у большинства из них ограничено несколькими месяцами. При дефиците иммунитета у больного возбудитель является причиной многочисленных, опасных для жизни зооантропонозных инфекций. Самая распространенная токсическая стафилококковая болезнь - это пищевое отравление. Многие штаммы золотистого стафилококка продуцируют энтеротоксин. Этот яд вызывает диарею, рвоту, боли и спазмы в животе. Согласно проведенного в Новой Зеландии исследования 8,6% детей, госпитализированных с сепсисом, вызванным Staphylococcus aureus, умирают. Дерматовенерологи многих стран обеспокоены увеличением количества стафилококковых инфекций и смертельных случаев из-за стафилококка. Бактерии вызывают порчу пищевых продуктов, включая и так называемые «непортящиеся» продукты. Размножаясь, например, в твердом сыре и салями, бактерии выделяют токсины. Именно они являются наиболее частой причиной серьезных пищевых отравлений. При кулинарной обработке стафилококк гибнет, но его термостабильные токсины не разрушаются. Стафилококки являются причиной множества болезней человека, включая сердечные (эндокардит и перикардит), опорно-двигательного аппарата (остеомиелит и инфекционный артрит). На коже и в мягких тканях стафилококк вызывает так называемый синдром шелушащейся кожи и целлюлиты , являющиеся наиболее частыми инфекционными болезнями кожи. По данным ВОЗ золотистый стафилококк возглавляет список бактерий, которыми наиболее часто заражаются в медицинских учреждениях. Высок риск инфицирования стафилококком при использовании внутривенных катетеров и других медицинских устройств, контактирующих с внутренней средой организма. Фактором риска является и искусственная вентиляция легких. Инфицирование стафилококком может также происходить при нарушении обычных правил гигиены в больницах. Всего на S. аureus приходится около 30% всех «госпитальных инфекций». Стафилококки, выжившие в условиях постоянного применения дезинфицирующих средств и использования антибиотиков - серьезнейший фактор риска для персонала, основа госпитальной инфекции.
Таксономия
Стафилококки - род шаровидных неподвижных аспорогенных грамположительных хемоорганотрофных факультативно-анаэробных или аэробных бактерий из семейства Micrococcaceae. В роду Staphylococcus выделяют около 30 видов, при этом 14 обнаружены на коже и слизистой человека, включая S. aureus , S. epidermidis, S. saprophyticus . Для видовой идентификации используют, в основном, 3 теста: продукцию плазмокоагулазы, анаэробную ферментацию маннита и глюкозы. Антигенная структура бактерии сложная, видоспецифичными антигенами являются тейховые кислоты.
Морфология бактерий и колоний
Бактериальные клетки диаметром 0,5-1,5 мкм делятся в нескольких плоскостях несимметрично, образуя скопления, напоминающие гроздья винограда. Встречаются одиночные клетки, пары и тетрады. Клеточная стенка содержит пептидогликан и глицеринтейховую кислоту. Стафилококки формируют гладкие колонии, окрашенные каротиноидами в желтый или оранжевый цвета. Однако пигментирование не является видовым признаком. При росте на желточно-солевом агаре образуются мутные круглые ровные колонии кремового, желтого или оранжевого цвета. При культивировании в жидких средах бактерии вызывают их равномерное помутнение, а затем образование рыхлого осадка, превращающегося в тягучую массу.
Физиолого-биохимическая характеристика
Стафилококки - факультативные анаэробы, но быстро и обильно растут при наличии кислорода. Хемоорганотрофы с окислительным и ферментатиывным метболизмом. Биохимичесчки очень активны. Продуцируют каталазу, на среде с глюкозой в анаэробных условиях большинство штаммов образуют ацетоин (положительная реакция Фогеса-Проскауэра). Выделяют аммиак при росте на аргениновом бульоне, восстанавливают нитраты до нитритов или молекулярного азота, активно гидролизуют белки, в аэробных условиях расщепляют многие углеводы до уксусной кислоты и углекислого газа. Родовым признаком является ферментация глюкозы в анаэробных условиях, что отличает стафилококки от микрокков. Бактерии растут на основных средах при 37°С (оптимум 35-40°С), но могут расти и в более широком интервале температур (6,5÷46°С). Оптимум роста отмечен при рН 7,0-7,5, но возможен рост в диапазоне рН=4,2÷9,3. Хорошо выдерживают повышенное осмотическое давление, поэтому элективным субстратом для них служат среды с высокой концентрацией хлорида натрия - желточно-солевой или молочно-солевой агар. Стафилококки хорошо переносят высушивание, сохраняя при этом вирулентность; погибают при прямом воздействии солнечного света в течение 10-12 часов. Довольно устойчивы к нагреванию: при 70-80 о С погибают за 20-30 мин, при 150 о С - за 10 мин; сухой жар убивает их за 2 часа. Бактерии устойчивы к действию низких температур, повторное замораживание и оттаивание их не убивает. Менее устойчивы стафилококки к действию дезинфектантов (перекиси водорода и др.), но резистентны к воздействию чистого этанола. При выращивании в аэробных условиях бактерии нуждаются в аминокислотах и витаминах, в анаэробных - требуют дополнительно урацил и дополнительные источники углерода. На кровяном агаре могут образовывать несколько видов гемолизинов - веществ, поражающих эритроциты, лейкоциты и другие клетки. Продуцируют также фибринолизин, фосфатазу, бактериоцины; отдельные штаммы продуцируют коагулазу, ДНК-азу, H 2 S и энтеротоксины (до 10 видов, характеризующихся летальным, гемолитическим или некротическим действием). Ферментируют некоторые углеводы с выделением кислоты без газа. Устойчивы к лизоциму, чувствительны к различным антибиотикам. Патогенные для человека виды обладают одним из 4 факторов токсичности, таким как: 1) экзотоксин, 2) энтеротоксин, 3) лейкоцидин, 4) коагулаза (фермент патогенности). Кросс-резистентность к антибиотикам контролируется R-плазмидой. Другим прокариотамэтот фактор устойчивостипередается трансдукцией.
Источники и факторы передачи инфекции
Стафилококки - условно патогенные микробы. Являются представителями нормальной микрофлоры человека и животных - густо колонизируют различные биотопы организма (кожу, слизистую носа и зева ротовой полости, брюшную полость и подмышечные области). Стафилококки внедряются в организм через кожные покровы и слизистые оболочки воздушно-капельным и воздушно-пылевым путем. Механизм инфицирования обычно связан с переносом возбудителя из участков колонизации на травматизированную поверхность (например, кожные покровы). Существенную роль играют также тесные контакты с носителями и лицами, страдающими стафилококковыми поражениями. Стафилококк устойчив ко многим внешним воздействиям, поэтому обнаруживается во внешней среде - воздухе (пыль), почве, на предметах обихода. Источники и факторы передачи стафилококковой инфекции множественные. Основные источники - больные со стертыми формами стафилококковой инфекции или носители, реже - заболевшие животные, например, (при пищевых стафилококковых отравлениях и энтероколитах) больные маститом коровы. Наибольшую эпидемиологическую опасность представляет медицинский персонал, который может являться носителем госпитальных штаммов стафилококка. Для стафилококковой инфекции характерна множественность механизмов, путей и факторов передачи. Бактерии могут передаваться контактно через нестерильный медицинский инструмент, руки медперсонала, алиментарно с молочными продуктами и кондитерскими изделиями, аэрогенно и парентерально (при инъекциях).
 |
Патогенез
Восприимчивость к стафилококкам очень низкая у лиц с нормальным иммунным статусом и повышенная у иммунокомпромиссных хозяев. Очень часто стафилококковая инфекция развивается на фоне вторичных иммунодефицитов. Факторами патогенности возбудителя является микрокапсула, компоненты клеточной стенки, ферменты агрессии и токсины. Микрокапсула защищает бактерии от фагоцитоза, способствует адгезии микробов и их распространению по тканям. При выращивании in vitro она не образуется. Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций и нейтрализуют иммуноглобулины, обездвиживают фагоциты. Тейховые кислоты запускают каскад комплимента (компонента иммунологических реакций) по альтернативному пути. Фермент агрессии стафилококков коагулаза существует в трех антигенных формах и вызывает свертывание сыворотки крови. При целом ряде патологических состояний организма стафилококки покидают свои обычные биотопы, преодолевают тканевые барьеры и привносятся кровотоком во внутреннюю стерильную среду организма. Там они вызывают типовую патологическую реакцию - воспаление. Оно проявляется в форме гнойно-воспалительных процессов различной локализации и степени тяжести, вплоть до сепсиса и септикопиемии. Стафилококки являются этиологическим фактором заболеваний, подавляющее большинство которых носят гнойно-воспалительный характер. Бактерии способны поражать практически любые ткани организма. Вызываемые S. aureus инфекции разнообразны и включают более 100 нозологических форм, в числе которых болезни: 1) кожи и подкожной клетчатки (абцессы, панариции, фурункулез и др.), 2) органов дыхания (ангина, плеврит, пневмония и др.), 3) нервной системы и органов чувств (менингит, отит, коньюктивит и др.), 4) органов пищеварения (стоматит, перетонит, энтерит, энтероколит, пищевая интоксикация и др.), 5) костно-мышечной системы и соединительной ткани (артриты, остеомиелит), 6) кровообращения (эндокардит, флебит и др.), 7) мочеполовых органов (цистит, мастит и др.), 8) стафилококковый сепсис . Эти заболевания могут протекать остро или хронически. Пищевые отравления клинически проявляются в форме рвоты и водянистой диареи уже через 2-6 ч после употребления в пищу инфицированных продуктов - кондитерских изделий с кремом, консервов, мясных и овощных салатов и т.д.
Методы обнаружения
На селективных дифференциальных средах вырастают, как правило, только колонии стафилококков. Предположить стафилококковую этиологию заболевания позволяет выделение стафилококка в чистой культуре. Биоматериал для исследования выбирается в зависимости от клинической картины болезни. У штаммов S. aureus, выделенных при пищевой стафилококковой интоксикации, определяют наличие энтеротоксинов в биологических и иммунологических тестах. Традиционными методами предварительные результаты по идентификации стафилококковой инфекции можно получить через 1-2 суток.
Классический метод
Метод обнаружения S. aureus основан на высеве навески продукта и/или разведений его навески в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и/или атипичных колоний к S. aureus.
Страница 38 из 91
ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
ПАТОГЕННЫЕ КОККИ
К патогенным коккам, вызывающим разнообразные по своим клиническим проявлениям заболевания у человека, относятся: 1) стафилококки, 2) стрептококки, 3) пневмококки, 4) менингококки и 5) гонококки.
По тинкториальному признаку (окрашиваемости) их можно разделить на две подгруппы: грамположительные кокки (стафилококки, стрептококки и пневмококки), грамотрицательные кокки (менингококки и гонококки).
Характерной особенностью всех патогенных кокков является способность вызывать гнойные воспалительные процессы, почему их называют также пиогенными (гноеродными) кокками.
Наиболее резко и постоянно гноеродные свойства выражены у стафилококков.
СТАФИЛОКОККИ
Морфология и тинкториальные свойства. Стафилококки- Staphylococcus (впервые выделены Пастером в 1880 г.) имеют форму правильных шаров со средним диаметром 0,8-0,9 мк. В мазке из чистой культуры стафилококки располагаются в виде кучек и скоплений, напоминая гроздь винограда (рис. 60). В гною и другом патологическом материале нередко можно встретить единичных кокков, парных и даже короткие цепочки. Они хорошо красятся основными анилиновыми красками, грамположительны, спор, капсул не образуют, неподвижны.
Культуральные и биохимические свойства. Стафилококки хорошо растут на обычных питательных средах как в присутствии, так и в отсутствии свободного кислорода. Температурный оптимум 37°.
Рис. 60. Стафилококк (а) и стрептококк (б) в чистой культуре.
Рис. 61. Колонии стафилококка на мясопептонном агаре. Ув. 20.
Рис. 62. Посев уколом в желатину.
Отдельные колонии на поверхности агара представляют собой округлые диски средней величины, выпуклые, влажные, непрозрачные, гомогенной или мелкозернистой структуры (см. рис. 01). Цвет колоний зависит от пигмента, который вырабатывают стафилококки и может быть золотистым (Staphylococcus aureus), лимонно-желтым (Staphylococcus citreus) и белым (Staphylococcus albus). При посеве штрихом на скошенный агар образуется обильный рост стафилококка, пигментированный.
Пигменты стафилококка относятся к липохромам, нерастворимы в воде и окрашивают только культуру, но не питательную среду. Образование пигмента идет интенсивно, когда микроорганизмы выращиваются в присутствии кислорода, при комнатной температуре, на свету.
При посеве уколом в желатину на 2-3-й день роста на поверхности среды заметна зона разжижения. По мере разжижения культура падает на дно в виде хлопчатого осадка (рис. 62).
На бульоне стафилококки дают обильный рост. Через 24 часа пребывания в термостате бульон мутнеет, и на дне пробирки образуется осадок.
Стафилококки быстро створаживают молоко, сообщая ему кислую реакцию.
Ферментируют (без газа) лактозу, глюкозу, мальтозу, маннит. Способность расщеплять маннит обычно характеризует патогенные штаммы стафилококка.
Патогенные стафилококки на чашках с кровяным агаром образуют колонии, окруженные зоной гемолиза, и свертывают плазму цитратной крови.
Резистентность. Стафилококк относится к числу весьма стойких микробов. Температура 80° убивает его во влажном состоянии в течение 10 минут. Температуру 70° стафилококки выдерживают до 1 часа. Карболовая кислота (3-5% раствор) убивает их в течение 15- 30 минут. В гною стафилококк сохраняется длительное время.
Токсины, ферменты стафилококков, патогенность их для животных. Патогенные стафилококки продуцируют ряд токсинов и ферментов. Стафилококковый гемолихин растворяет эритроциты. Этот токсин термолабилен (разрушается при 55°), относится к экзотоксинам и при иммунизации им животных можно получить антитоксин. Фильтрат культур стафилококка обладает также некротическим и летальным действием. В настоящее время доказано, что гемолизин, некротоксин и летальный токсин являются составными частями единого стафилококкового экзотоксина. Эти токсины неотделимы друг от друга, и обнаружение одного из них служит доказательством патогенности выделенного стафилококка. Некоторые из гемолитических штаммов золотистого стафилококка вырабатывают энтеротоксин, вызывающий явления острого гастроэнтерита. В фильтратах культур стафилококка часто обнаруживается лейкоцидин - яд, разрушающий лейкоциты. Из ферментов патогенные стафилококки выделяют: 1) плазмокоагул а з у - свертывающую плазму, 2) фибринолизин - растворяющий сгустки фибрина, 3) гиалуронидазу - растворяющую гиалуроновую кислоту, вещество склеивающее элементы соединительной ткани, 4) пенициллиназу - инактивирующую пенициллин и 5) лецитиназу - образует зону помутнения вокруг колоний на желточно-солевом агаре (среда Чистовича).
Из лабораторных животных наиболее чувствительны к стафилококку кролики и в меньшей степени морские свинки и мыши. У кроликов при внутрикожном введении культуры появляется резко выраженный некроз, при подкожном - развиваются абсцессы, а заражение высоковирулентными штаммами стафилококка приводит к сепсису и гибели животных. К стафилококковому энтеротоксину наиболее чувствительны котята-сосунки и молодые мыши.
Классификация стафилококков. Старая классификация стафилококков по выделяемому ими пигменту (золотистый, белый и лимонно-желтый) не дает возможности правильно определить их патогенность. Поэтому в настоящее время считают наиболее верной классификацию стафилококков, предложенную Гроссом. Согласно этой классификации, все стафилококки разделяются на три группы: патогенные, слабопатогенные и непатогенные.
Первая группа - патогенные стафилококки:
а) на чашках с 5% кровяным агаром образуют четкую зону гемолиза;
б) при внутрикожном введении кролику вызывают явления резко выраженного некроза, заканчивающегося иногда смертью животного;
в) продуцируют фермент плазмокоагулазу, вызывающую свертывание плазмы в течение 2 часов;
г) выделяются главным образом от больных сепсисом или острой гнойной инфекцией.
Вторая группа - слабопатогенные стафилококки:
а) на чашках с кровяным агаром образуют зону слабовыраженного неполного гемолиза;
б) при внутрикожном введении кролику вызывают в месте введения покраснение кожи, иногда инфильтрат, чаще без явлений некроза;
в) при посеве в цитратную плазму вызывают свертывание в течение 6 часов и позже;
г) выделяются с поверхности кожи при фолликулите, со слизистых оболочек при катаре верхних дыхательных путей, с поверхности ран, но не из глубины их.
Третья группа - непатогенные стафилококки:
а) на чашках с кровяным агаром гемолиз не обнаруживается;
б) при внутрикожном введении кролику явления некроза и инфильтрата не отмечаются, в отдельных случаях появляется покраснение кожи;
в) реакция плазмокоагуляции отрицательная;
г) обнаруживаются постоянно на здоровой коже, на слизистых оболочках зева, носа и в воздухе.
Патогенез и заболевания у человека. Стафилококки являются очень распространенными микробами. Их находят в воздухе, воде и почве, у человека - почти постоянно на коже и слизистых оболочках. Этим объясняется тот факт, что стафилококк является наиболее частым возбудителем всевозможных нагноений. Повреждение кожи и слизистых оболочек или понижение их резистентности открывает «ворота» для стафилококковой инфекции.
Чаще всего поражается кожа. Стафилококки являются возбудителями фурункулов - гнойного воспаления волосяных мешочков. Если фурункулы приобретают множественный характер, заболевание называется фурункулезом. Когда несколько фурункулов сливаются вместе, образуя более обширный гнойный инфильтрат, возникает карбункул.
Стафилококки встречаются при абсцессах (гнойниках), в гноящихся ранах, при катарах слизистых оболочек, септицемии и септикопиемии (сепсис с образованием гнойных очагов во внутренних органах). Энтеротоксические штаммы золотистого стафилококка могут вызывать пищевые отравления. Последние наблюдаются в результате употребления зараженного стафилококком молока и других молочных продуктов, пирожных с кремом и т. д., так как в этих продуктах стафилококк находит оптимальные условия для своего размножения. В молоко патогенные стафилококки могут попасть или от коров, больных маститом, или с рук доярок, страдающих пиодермией.
Иммунитет. Врожденного иммунитета к стафилококку у людей не существует. Однако человек обладает значительной устойчивостью к этому микроорганизму, что объясняется защитной ролью кожи и наличием в крови антител.
По-видимому, может иметь место приобретенный иммунитет, о чем свидетельствует повышение титра антител у больных и переболевших. Однако этот иммунитет нестоек. Более того, отмечено, что у многих людей, перенесших фурункулез, возникает повышенная восприимчивость к стафилококку.
Сопротивляемость к стафилококку может ослабляться вследствие разных причин - диабета, травмы, истощающих заболеваний и т. д.
Микробиологическая диагностика. Исследование гноя. Чаще всего материалом для микробиологического исследования служит гной. Для этой цели при открытых поражениях после предварительного очищения раневой поверхности стерильным ватным тампоном достают отделяемое из более глубоких частей раны. При закрытых процессах (фурункул, абсцесс) с этой же целью после дезинфекции кожи производится пункция очага нагноения стерильным шприцем. Из полученного гноя делают мазки, окрашивают синью и по Граму и микроскопируют.
По расположению кокков и тинкториальным свойствам трудно дифференцировать стафилококки и стрептококки, поэтому переходят к бактериологическому исследованию, т. е. к посеву гноя на чашки с простым, кровяным агаром, на желточно-солевой агар (см. раздел «Санитарная микробиология» стр. 454) и на среду обогащения (сахарный бульон). Засеянные чашки, перевернув вверх дном, и бульон ставят в термостат при 37° на 1-2 суток.
На чашках с кровяным агаром колонии образуют зоны гемолиза, диаметр которых часто в несколько раз превышает диаметр колонии. Эти прозрачные бесцветные зоны гемолиза образовались вследствие растворения эритроцитов, вызванного гемотоксином стафилококка. На чашках с желточно-солевым агаром патогенные стафилококки вырастают с образованием золотистого пигмента и зоной помутнения - в виде радужного венчика вокруг колонии. С одной из колоний готовят препарат, окрашивают по Граму и микроскопируют. Обнаружение в препарате грамположительных кокков, расположенных в виде гроздей винограда, дает право выдать ориентировочный положительный результат. Затем остаток колонии пересевают на скошенный агар для получения чистой культуры. Необходимо дифференцировать патогенный стафилококк от непатогенного, т. е. изучить рост на кровяном агаре, желточно-солевом агаре, посеять в нитратную плазму и определить токсигенность на животных.
Проба на плазмокоагуляцию. Для реакции плазмокоагуляции Г. В. Выгодчиков рекомендует следующую методику. У кролика берут 10 мл крови из сердца, помещают в пробирку с 1 мл 5% раствора лимоннокислого натрия. Кровь центрифугируют и отсасывают плазму. Полученную плазму перед опытом разводят физиологическим раствором 1:4 и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл. Колонии стафилококков засевают петлей в пробирки с нитратной кроличьей плазмой, ставят в термостат при 37° и проверяют свертывание плазмы каждые 2-3 часа. Патогенные стафилококки коагулируют плазму в течение 2-10 часов чаще всего в течение 4 часов.
Проба на токсигенность. Токсигенность стафилококковых культур определяется опытом на кроликах, а энтеротоксин - на котятах-сосунках. Из туры стафилококка на скошенном агаре приготовляют взвесь микробов в физиологическом растворе и устанавливают по оптическому стандарту с расчетом 2 млрд. микробных тел в 1 мл взвеси. На боку или спине у кролика выщипывают шерсть и внутрикожно вводят животному по 0,2 мл микробной взвеси. При положительной реакции на месте инъекции образуется инфильтрат, а затем и некроз.
Для обнаружения летального токсина кролику внутривенно вводят фильтрат бульонной культуры стафилококка из расчета 0,75 мл на 1 кг веса. Смерть животного наступает через 15 минут.
Для определения энтеротоксина котят 1,5-2-месячною возраста (весом 400 г) вскармливают исходным зараженным продуктом или молочной культурой стафилококка. Признаки отравления (понос, иногда рвота) наступают через 30-60 минут. Наблюдение ведут 4- 6 часов, и если за это время у котят не будет никакой реакции, биологическая проба считается отрицательной.
Исследование крови. При подозрении на сепсис у больного из локтевой вены стерильно с помощью шприца берут 10 мл крови и засевают в 100-200 мл сахарного бульона. Посев ставят для обогащения на 24-48 часов в термостат. В положительном случае среда мутнеет, а в мазках из нее обнаруживаются грамположительные кокки, имеющие характерную форму и расположение. Из бульона делают пересев в чашку с кровяным агаром и дальнейшее исследование ведут так, как описано выше. Бульон выдерживают в термостате 10 суток, производя каждые 2 дня высев на 5% кровяной агар.
Исследование других материалов. При исследовании материалов, загрязненных большим количеством посторонних микробов (испражнения, мокрота), рекомендуется применять агар с 7,5% хлорида натрия, к которому добавляют 10% теплого снятого молока (среда Петрович). На таком агаре рост посторонней микрофлоры значительно подавляется.
Фаготипирование. При фаготипировании используют набор типовых стафилококковых фагов, состоящих из 21 фага, разделенных на четыре группы. Каждый типовой фаг способен размножаться только на соответствующем ему штамме стафилококка. Фаготипирование стафилококков имеет особое значение при са-
санитарно-бактериологическом исследовании пищевых продуктов для выявления источника инфекции и установления эпидемических связей.
Специфическая терапия и химиотерапия. Стафилококковая вакцина широко применяется для лечения рецидивирующих и хронических инфекций, например, при фурункулезе. Для профилактики этих заболеваний применяется анатоксин.
При лечении стафилококковых инфекций с успехом используют также химиотерапевтические препараты сульфаниламидного ряда (норсульфазол, сульфодимезин и др.), антибиотики (пенициллин в больших дозах, эритромицин, оксациллин и др.), стафилококковый бактериофаг (при поражениях кожи). При тяжелых стафилококковых сепсисах рекомендуются гипериммунная антистафилококковая плазма и гамма-глобулин, получаемые от доноров, иммунизированных анатоксином.
